AAV基因治疗药物分析技术及挑战

在2012年，欧盟批准了首个的基因治疗药物Glybera（格利贝拉）上市。尽管后来由于商业原因该药物退出了市场，但这一批准意味着基因治疗研发迎来了全新的时代。此后，基因治疗相关的临床试验数量呈爆发性增长的趋势，截至到目前全球基于病毒载体的体内基因疗法14款被批准上市。

AAV基因治疗开发蓝图：

对于基因治疗产品，有两个关键方面需要特别关注：首先是它所递送的目标基因(GOI)，其次是用于递送目标基因的载体。基因治疗的载体分为两种主要类型，一种是病毒类载体，另一种是非病毒类载体。

腺相关病毒（AAV）作为病毒类载体具有独特的优势，AAV具有强大的组织特异性，可以在体内稳定地长期表达目标基因；与染色体整合的风险极小，免疫原性也很低，几乎无致病性。因此，基于这些优点，AAV疗法已经逐渐成为一种先进的治疗方法。

目前已经分离出100多种以上的AAV血清型，不同血清型的AAV可以靶向不同的细胞和组织器官，适应症包括眼科、耳科和神经科等领域的局部给药疾病，以及代谢性疾病、血友病和心血管相关疾病等全身系统性给药疾病。随着基因治疗药物的深入研发，AAV基因疗法也已在自免疾病和肿瘤等领域取得重大突破，为医学领域带来更多的创新和治疗选择。

目前国内共25款AAV基因治疗药物IND申报获批，其中3款进入III期临床。此外，我们可以看到已经有多种与AAV相关的基因治疗药物获在欧美批准上市，AAV基因治疗的发展前景广阔。

rAAV药物设计和生产工艺流程：

重组的AAV（rAAV）是由两部分组成：一部分是病毒表面的衣壳，衣壳蛋白(Cap)有3种，分别为VP1、VP2和VP3，AAV衣壳是由60个VP1、VP2和VP3组成的20面体结构，VP1、2、3的组成比例大概是1:1:10；另外一部分是衣壳内所包裹的基因。野生型的AAV约是4.7kb的线性单链的DNA基因组，两端为倒转末端重复序列（Inverted Terminal Repeat，ITR），ITR中间是有两个基因，一个是跟它的复制相关的Rep基因，另一个是与衣壳蛋白表达相关的Cap基因。rAAV疗法的设计原理是把AAV中的Rep和Cap基因换成需要的目的基因（GOI），然后通过AAV来进行递送。

rAAV的生产工艺路线包括以下流程：1.上游的病毒包装；2.下游的病毒纯化；3.制剂分装。所以rAAV生产工艺开发从这3个流程考虑，其中AAV的病毒包装系统现在比较常用的是三质粒转染系统，三质粒转染的方式可以基于悬浮细胞体系或是贴壁细胞体系。而下游的病毒纯化工艺通常包括细胞裂解、超滤、亲和层析、离子交换层析以及浓缩等等过程。最后的制研工艺开发主要考虑点是提高AAV产品保存稳定性，通常AAV的保存体系里面需要维持一定的盐离子的浓度，所以辅料中通常需要添加一些稳定剂，比如说蔗糖、泊洛沙姆等。

了解了AAV的特点和AAV药物的设计原理和工艺研究考虑点，更加有利于理解下文介绍的AAV药物的分析技术和挑战。

一个可靠的药物分析方法，是由多个要素组成，包括但不限于：

● 经过校验的仪器设备，并且使用应该在效期内；

● 人员需要经过适当的培训；

● 所使用的试剂、耗材和原材料应该是有可靠稳定的供应商来源，而且应该在效期内进行使用；

● 经过确认/验证的分析方法。

而分析方法并不是一成不变的，分析方需进行全生命周期管理，贯穿了整个药物研发的全流程：

● 研发的早期可能只需要做一些方法学的开发，或者是简单的适用性研究，到临床I/II期阶需要进行方法的确认以及部分验证。

● 到了关键临床阶段，也就是BLA/NDA阶段需要进行一个全面的方法学验证。

● 上市之后分析方法需要进行日常的维护和验证状态再评估。

● 同时涉及到需要对分析数据进行趋势的分析，如果发现这个方法可能出现一些不适用的情况，需要做方法的修订，或者是方法的变更，抑或是用新的技术平台去替代原有的旧的方法。

AAV基因治疗药物分析平台的建立要结合通用要求和AAV药物分析目标，分析目标指的是产品的关键质量属性（CQA）。在药物研发的不同阶段，所关注的关键属性是不一样的:

● 药物开发的早期更加关注产品生物学特性相关的质量属性，比如血清型组织特异性分布、转导活性、免疫源性、成药性产量分析、成药性活性分析、成药性杂质分析等。

● 到了工艺开发阶段更关注产量、空壳率、聚集比例、错包率、宿主DNA残留（HCD）、效价（potency）和初步的杂质研究。

● 到了更大规模的中式生产阶段，就需要对产品进行全面的研究，涉及到鉴别、含量、效价（potency）、纯度、安全性、杂质等。

AAV药物所用的技术平台和蛋白类药物很多都是相同的地方，比如用的ELISA、HPLC、LC-MS、SEC-MALS等。AAV药物也有比较特殊的分析技术，包括但不限于ddPCR、分析超离（AUC）技术、测序相关的一代、二代测序等。

AAV的定量分析方法：

对于AAV的定量分析方法需要从多个维度体现，AAV药物含量检测通常称之为滴度检测。AAV的滴度有物理滴度和感染滴度。物理滴度包括病毒衣壳滴度和基因组滴度。对于病毒衣壳滴度，通常用ELISA或表面离子共振的方法来进行分析。对于基因组滴度的分析，最早时候通常用qPCR检测，随着数字PCR平台的成熟，其已经渐渐替代了qPCR成为滴度检测主流的平台。微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）相对于qPCR有独特的优势。ddPCR是一种绝对定量的方法，不需要使用标准曲线就可以进行定量；ddPCR对于整个反应体系里面的干扰物的耐受性更好，即使使用不同的前处理方式，ddPCR的结果一致性也比较好，同时相对qPCR，它的一个方法检测的变异性会更小，偏差会更小些。

对于感染滴度分析，现在普遍使用的是TCID50的方法（半数细胞培养感染剂量），测定AAV进入细胞并利用细胞内物质复制和产生子代感染性病毒颗粒的能力。但是TCID50方法结合了细胞病毒感染和PCR检测，方法比较复杂，且变异性比较大，可达到50%。除了TCID50的方法，也有其他一些方法，比如感染中心检测法（infectious center assay，ICA），也用于感染滴度的分析。

AAV治疗产品potency分析：

关于AAV治疗产品potency分析是AAV药物开发中比较大的难点之一，因为AAV产品特异性大，很难建议平台方法，转基因功能不清楚或是具有复杂的作用机制（MOA），导致potency方法开发周期长和结果变异性大。

目前potency方法可以使用RT-PCR的方法来分析目的基因的转入水平（mRNA），也可以利用western blot/ELISA方法检测目的蛋白的表达，或是更进一步结合bio-assay分析表达产物的生物学活性。目前法规对于这一块并没有明确要求采用什么方法，但是FDA potency指导原则建议potency方法应代表产品的作用机制，应考虑基因转移的测量指标和所转移基因的生物学效应，同时建议开发多个互补试验，测定与质量、一致性和稳定性相关的不同产品属性。

AAV产品的相关杂质检测：

AAV病毒包装是非常复杂的一个生物学过程，在这个过程中可能会产生比如空包、错包或者是部分包装的情况，也可能会产生各种聚集体，所以对于AAV产品的相关杂质进行表征也有很大挑战。对于这些杂质的分析，现在常用的是分析型超速离心（analytical ultracentrifuge，AUC）方法，由于不同形态AAV的沉降系数不一样，从而可通过超速离心达到分离检测、获取不同形态AAV的比例信息，AUC优势是重复率高，变异性低，能识别部分包装的病毒，但AUC方法分析周期长，需要样本量大，一定时间内处理样本量也有限。所以关于AAV杂质的表征和放行检测，会结合多种方法进行检测，包括HPLC、DLS（dynamic light scattering）等

AAV药物的高级结构：

AAV分子量很大，大概有4000到5000KB，AAV药物的高级结构表征也是个难点。AAV药物特点很难用传统的自上而下策略来进行结构表征，通常AAV是用自下而上的策略进行AAV蛋白的高结构表征。AAV的衣壳蛋白被消化成各种大小不一的肽段，通过对这些肽段的分析进行AAV的衣壳蛋白的高级结构表征。涉及到的检测项目，包括氨基酸序列和VP1、2、3摩尔比例以及各种反应后修饰，脱酰氨、氧化、磷酸化反应修饰。对于AAV基因组的表征，可利用二代NGS测序或者是三代测序。

总结：

AAV产品质量分析挑战主要来自于AAV本身分子结构的复杂性，和生产工艺的复杂性。

● AAV是一个活的结构复杂的病毒，而且外壳蛋白表面也存在着大量的翻译后丢失，所以AAV药物分析比一般的重组蛋白药物更复杂。

● AAV本身包装过程是复杂的生物学过程，存在错包、部分包装、空包的风险。

● 对于现在通用的三质粒共转染的生产工艺，工艺不稳定，存在着质量不一致性的风险。

● AAV药物本身的稳定性也是存在很大挑战，通常需要在-60℃以下温度长期保存。

● AAV药物分析标准品通常是采用企业内部自制参考品，但是对于这类参考品有比较大的稳定性挑战。病毒参考品和实际样本是保存在相同温度，但病毒参考品如果用于活性分析的时候，有可能会出现参考品和供试品的活性同步下降，但是比活性却没有变的情况，这样很难反映产品活性的真实变化。

● 因为产品杂质的复杂性，目前对杂质的分析手段也比较局限。

● 目前为止对于AAV类产品的特性研究并不充分，相关的一些检测方法也是发展比较滞后的，前面提到的AAV的potency的定量分析难度很大，方误差很大，CV可能会达到50%，甚至100%这个水平。

● AAV药物的分析对于设备的要求很高，所以导致它的放行成本也很高，比如ddPCR、HPLC检测用的设备比较昂贵。

参考文献：

1.  Andreas L. Gimpel Georgios Katsikis , Sha Sha, et al.. Analytical methods for process and product characterization of recombinant adeno-associated virus-based gene therapies. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 20 March 2021.

2. Neil G. Rumachik1, Stacy A. Malaker, and Nicole K. Paulk. Method for Bottom-Up Proteomic Characterization of rAAV Capsid Post-Translational Modifications and Vector Impurities.Frontiers in Immunology,April 2021 Volume 12.

3.  FDA指导原则 Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products

相关文件下载、服务及学习课程：

合规文库：ICH Q2 分析方法验证

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