附件 15 体内彗星试验 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay 1 范围 本规范确定了体内彗星试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。 2 试验目的 评价化妆品用原料的遗传毒性。 3 定义 3.1 碱性单细胞凝胶电泳： 在单个细胞或细胞核水平检测 DNA 损伤的一种敏感技术。 3.2 彗星：经过电泳后细胞核的形状，形似彗星。细胞核部分形成彗星头部，在电场力的 作用下脱离细胞核的 DNA 片断形成彗尾。 3.3 “ 刺猬状 ” 细胞：显微图像下由小或模糊不清的头以及大的弥漫性尾组成的细胞。 3.4 尾部 DNA 含量 ： 反应总强度 （ 彗头与彗尾之和 ） 中彗星的强度 。 可反应 DNA 片断的 数量，用百分比表示。 3.5 最大耐受剂量：试验期内引起动物产生轻微毒性效应的最高剂量，在这个剂量下，动 物产生明显的临床体征 ，如异常行为或反应 ，轻微的体重下降或靶组织细胞毒性 ，但是并不 会引起死亡或痛苦。 4 试验原理 DNA 双螺旋结构在强碱性溶液中 （ pH>13 ） 会松弛 ， 在电场力的作用下 ， 正常的 DN A 保留在原位不动，而单链或双链 DNA 断裂所形成的 DNA 片断在会向阳极移动，形成彗星 状。 DNA 片断所形成的彗星状拖尾的长度及强度可以反应 DNA 片断的大小和数量。通过 检测尾部 DNA 含量（ %）等终点指标可以评价 DNA 损伤程度。 5 试验基本原则 动物染毒一定时间后处死并解剖动物 ，获取靶器官 ，制备单细胞悬液 。单细胞悬液与琼 脂糖混合后经过裂解过程去除细胞膜，并暴露于强碱性溶液（ pH>13 ）中进行 DNA 解旋， 经过电泳 、固定 、染色 ，在荧光显微镜下观察 ，通过分析软件对彗星状细胞进行分析 ，判 定 DNA 损伤程度。每个样品需分析足够数量的细胞进行最终结果评价。 6 溶液的配制（所有溶液均现用现配） 6.1 0.5%(w/v) 低熔点凝胶