关于公开征求《慢病毒载体RCL检测问题与解答（征求意见稿）》意见的通知

细胞与基因治疗产品中广泛使用的慢病毒载体，其生产过程中可能产生可复型慢病毒（RCL），给临床应用带来较大的安全性风险，因而需将RCL作为细胞和基因治疗产品的关键质量属性进行控制。为进一步促进细胞和基因治疗产品的发展，并规范和指导企业慢病毒载体RCL检测方法开发，我中心在前期调研的基础上，结合国内外相关法规、技术要求及专家研讨意见，并根据当前技术发展和科学认知，起草了《慢病毒载体RCL检测问题与解答（征求意见稿）》，总结并分析RCL检测方法要素及方法学验证等方面的共性问题。现通过中心网站向社会各界公开征求意见，诚挚欢迎社会各界对征求意见稿提出宝贵意见和建议，征求意见时限为自发布之日起1个月。

如有反馈意见，请填写征求意见反馈表，并通过以下联系人邮箱反馈于我中心。

联系人： 刘 丹，崔 靖

邮箱：liudan@cde.org.cn; cuijing@cde.org.cn

感谢您的参与和大力支持！

国家药品监督管理局药品审评中心

2023年10月13日

附件：

1、《慢病毒载体RCL检测问题与解答（征求意见稿）》

2、《慢病毒载体RCL检测问题与解答（征求意见稿）》起草说明

3、《慢病毒载体RCL检测问题与解答（征求意见稿）》征求意见反馈表

慢病毒载体RCL检测问题与解答

（征求意见稿）

一、概述

近年来，慢病毒载体在临床上得到广泛应用，其可以直接作为载体产品用于人体，也可以介导目的基因在靶细胞（如T细胞）的转移和表达以制备体外基因修饰细胞用于人体。目前临床使用的慢病毒载体系统经过了改造和优化，比如删除非必需基因、减少转移质粒与包装质粒序列间的同源性、降低质粒载体/辅助基因序列与包装细胞DNA之间的同源性、将辅助基因序列分离于不同的质粒中，以降低同源/非同源重组形成可复制型慢病毒（Replication competent virus, RCL）。虽然这些改造极大降低了形成可复制型病毒的风险，但考虑到可复制型病毒形成机制和结构较为复杂，目前各国监管机构仍将RCL检测作为慢病毒载体质量研究和控制的重要项目。

稳定的慢病毒载体包装细胞系不容易制备和获得，通常使用多个质粒瞬时转染细胞用于慢病毒载体的生产。目前临床上使用的慢病毒载体系统通常是基于HIV-1病毒骨架结构并采用水泡型口炎病毒糖蛋白（VSV-G）进行了包膜替换，下文所述内容也是针对这类慢病毒载体系统生产中产生的RCL提出一般性建议。根据目前国内申报细胞和基因治疗产品情况，慢病毒载体采用细胞培养法进行RCL检测大多数委托第三方检测机构，但也有部分企业采用自建方法。由于我国目前尚未颁布针对RCL检测的针对性技术指南，因而在检测样品、检测量、检测方法和方法学验证等方面存在诸多共性问题。药品审评中心结合初步调研情况以及国外监管相关技术指南的要求，形成这些问题的初步建议，以供申请人/检测机构参考。

二、常见问题与解答

1、检测样品

问题1．慢病毒载体生产阶段，载体上清液和生产终末细胞同时检测或选择其一？每个生产批次的病毒载体上清液和生产终末细胞是否均要求检测RCL？

答复：

慢病毒载体的生产通常采用瞬时转染体系，根据RCL形成机制，在细胞包装/生产阶段可能发生同源或者非同源重组形成具有复制能力的病毒，而在病毒上清液收获后至纯化阶段形成具有复制能力的病毒的可能性极小，且考虑到基因重组形成RCL的风险在批次之间可能存在差异，且研究发现病毒载体上清液和EOPC中并不总是一致的检测到RCL，因而为了确保病毒载体阶段无RCL污染的风险，建议每个临床试验用批次的病毒载体上清液和生产终末细胞（EOPC）均需要采用细胞培养法进行RCL检测。

问题2．采用细胞培养法检测RCL样品是选择未处理的病毒上清液、还是选择经过浓缩后的病毒上清液、或者选择纯化后的病毒成品？

答复：

通常情况下，应选择最易检出RCL的样品进行检测。考虑到下游纯化工艺可能会破坏样本中可能存在的RCL，因而，在条件允许情况下，检测样品优先选择未处理的病毒上清液。

但是按照慢病毒实际的商业化生产工艺情况以及取样量计算的要求，可能存在上清液取样量较大，现有的检测条件和检测能力无法满足要求的情况，因而，也可以考虑选择经过浓缩处理的病毒上清液或病毒成品进行RCL检测，但需要提供充分依据证明纯化工艺及相关操作不会破坏RCL。需要特别关注，经浓缩处理的病毒上清液或者病毒载体成品浓度较高，可能对扩增细胞有毒性，因而试验中需要充分考虑检测样品对检测方法的干扰。

2、检测量

问题1．病毒上清液取样量如何计算？慢病毒检验时可能还未获得实际转导参数（如MOI、最大细胞量和病毒滴度），如何基于计算公式计算检测体积？如果取样点在慢病毒收获液阶段，直接按照收获液的测定滴度代入公式计算合理还是按照慢病毒成品滴度计算后再除以慢病毒批次的收率合理？

答复：

根据早期使用逆转录病毒载体的经验（包括生产经验和临床使用经验），建议测试至少5%的总上清液或300ml（总体积大于6L时），以确保病毒载体中无RCL污染的风险。但随着工艺优化及发展，以及临床使用经验的持续积累，推荐测试足够的病毒上清液，以确保取样量满足检测出1RCR/剂量的可能性为95%。考虑到实际生产时可能还未完全确认慢病毒转导体外细胞的最大剂量信息，故无法基于计算公式得到需要检测的病毒上清液的最大量，也可以考虑采用5%的总上清液或300ml进行取样。

按照现行FDA指南中计算公式，对于体外转导细胞计算剂量当量时使用的病毒滴度是病毒成品的滴度，按照此滴度计算后得到的检测体积并非是直接用于检测的病毒收获上清液的体积，实际检测体积还应在此计算公式计算体积基础上除以病毒载体批次的实际收率，或者以病毒收获上清液批次的实际测定滴度带入公式进行计算。

资料中应详细提供样品检测量计算的过程及依据，以确保检测量满足检测出1RCL/剂量的可能性为95%。

问题2．生产终末细胞检测量按照总细胞量的1%或1×10 8个（以较小计算量作为检测用量）是否可以？

答复：

生产终末细胞（EOPC）指收获病毒上清液阶段分离的细胞或者多次收获病毒上清液最后获得的细胞。检测量通常按照总细胞量的1%或1×108个（以较小计算量作为检测用量）进行检测。

3、检测方法

问题1．细胞共培养法检测RCL只进行连续扩增培养，而不在扩增期后增加指示期是否可行？

答复：

由于缺少辅助基因的病毒可能相比野生型病毒生长速度有所减缓，另外，虽然p24在扩增阶段结束时通常低于检测限，但慢病毒载体中p24的高浓度偶尔会导致21天时仍能检测到低水平的p24。此外，在没有RCL的情况下，在扩增期细胞中可能发生低水平的序列转移（如psi-gag或VSV-G）（可能是由于残留质粒污染），但在经过指示期培养后再次进行检测可以确保检测结果的准确性和可靠性。但是如果在扩增阶段有充分数据证明连续传代培养可以去除残留的蛋白（如P24蛋白）和质粒残留导致的假阳性风险，或者在扩增阶段供试品组可以观察到细胞病变，则可不进行指示期培养。如不能提供充分数据，则建议将病毒载体上清液和生产终末细胞与允许细胞系共培养并至少连续5次传代，以扩增任何潜在的RCL，在扩增培养结束后对共培养物进行离心处理，将收集的上清液再次与初始C8166细胞进行共培养作为指示期，并收集指示期的样品进行RCL的检测。

问题2．细胞共培养法检测RCL仅选择一种终点检测方法是否可行？

答复：

由于RCL形成机制较为复杂，结构尚不明确，目前常见的几种检测终点指标均是基于RCL理论上的结构选择的终点指标以侧面反映是否有RCL。但由于不同的终点检测方法适用性不同，因而，鼓励申请人在进行RCL检测时采用不同原理的终点检测方法，比如可以考虑选择序列检测（病毒序列的PCR）与功能（标记物PERT）或蛋白表达（p24 ELISA）检测一起用于RCL检测，以相互验证检测结果的真实性和可靠性。但需要注意，如果两个终点检测结果都为阳性，则一般可判断RCL阳性，如果一个终点结果呈阳性另一个终点结果呈阴性，则需要提供充分的调查和研究资料，以确认检测结果的可靠性。

问题3．以HIV-1为基础的慢病毒载体选择阳性对照病毒的一般考虑？比如野生型HIV-1、减毒HIV-1（包膜保留野生型病毒包膜还是替换为VSV-G包膜）等？阳性病毒需要提供哪些研究数据？

答复：

临床使用的慢病毒的包膜蛋白大多数为VSV-G，理论上使用以VSV-G包膜蛋白的HIV-1毒株作为阳性对照，比使用野生HIV-1或减毒的HIV-1更合理。但是由于编码异源Env（例如VSV-G）和Gag/Pol的阳性病毒对人员和环境具有较大的危害，且目前尚未有充分证据表明RCL与野生型HIV-1具有相似的生长特性和理化特性，也未有充分证据表明RCL与VSV-G包膜蛋白的HIV-1毒株具有相似的生长特性和理化特性。所以，考虑到阳性病毒的生长特性、毒力和分析人员的安全性，一般不建议使用野生型HIV-1和VSV-G包膜蛋白替换的HIV-1毒株作为RCL检测的阳性对照病毒，建议选择HIV弱毒株或重组的条件复制型慢病毒载体作为阳性对照病毒。

阳性病毒对于确认检测方法的灵敏度至关重要，因而建议申报资料中提供阳性病毒的来源、制备工艺、主要功能元件及生物学滴度的详细资料。

问题4．实验组设置的要求？实验组中是否必须设立抑制对照组？如是，是否每一批次载体上清液/生产终末细胞检测时均需要设立抑制对照组，还是在方法验证时设置抑制对照组？

答复：

实验组通常包括阳性对照、阴性对照、抑制对照组和样品组。阳性对照和阴性对照组对于评估方法的专属性、灵敏度和重现性至关重要，因而实验组中应设置合理的阴性对照和阳性对照。

由于进行RCL方法验证时使用的样品与实际试验测定用样品可能在病毒滴度、基质成分等方面均存在不同，且研究发现高滴度慢病毒上清液可能对共培养细胞的扩增有抑制作用，进而影响RCL检测灵敏度。同时，检测样品中除病毒以外的其他组分可能也会影响RCL的检测。所以在每个批次实际样品检测时均建议设置抑制对照组，以证明检测样品对阳性病毒的检出无影响。抑制对照组的设计通常是在检测样品中加入阳性病毒，阳性病毒的加入量可参考检测方法的检测限。

问题5．共培养细胞的选择除了C8166细胞外，其他细胞是否可以选择？是否需要建库和检定？

答复：

细胞系的选择和病毒的包膜有关，同时也要考虑细胞可否支持HIV病毒核心的复制，通常选择病毒易感和易复制的细胞系作为共培养细胞。鉴于目前C8166细胞已经作为比较公认的VSV-G假型HIV-1和相关慢病毒易感的细胞系，所以建议优先选择C8166细胞用于SV-G假型HIV-1和相关慢病毒RCL检测时的共培养细胞。如选用其他细胞系应开展全面的表征研究，并验证方法能达到等效性后方可考虑作为共培养细胞。

C8166细胞应按照《中国药典》检定用细胞相关要求提供全面的研究资料，如合法来源证明性文件、细胞库建库过程资料、细胞库检定研究资料等。

4、方法学验证

问题1．RCL检测方法学验证的要求？

答复：

RCL的检测分为共培养和终点检测两个实验阶段，验证也需要考虑开展两个阶段的验证。共培养阶段应设立合理的阳性对照组、阴性对照组和抑制对照组，并根据终点检测结果进行最终试验结果的判断，通常开展的验证项目包括专属性、检测限、耐用性等，专属性应考虑阳性对照组检出率、阴性对照检出率和抑制对照组检出率，检出率的设定标准应有合理的依据。检测限验证通常通过设置不同稀释度的阳性对照，并确保检出率达到一定标准。耐用性验证应结合可能影响方法的因素进行设置，比如传代代次、传代时间、细胞密度等。RCL的终点检测方法通常是基于分子生物学的定量或定性方法，可根据ICH Q2、现行版《中国药典》关于分析方法验证相关指导原则要求开展相应的验证，一般情况下，定量检测方法应进行专属性、检测限、准确度、精密度、线性、范围和耐用性等项目的验证，定性检测方法应进行专属性和耐用性的验证。

三、参考文献

1. FDA. Guidance for Industry–Supplemental guidance on testing for replication competent retrovirus in retroviral vector based gene therapy products and during follow-up of patients in clinical trials using retroviral vector. 2006.

2. FDA. Testing of Retroviral Vector-Based Human Gene Therapy Products for Replication Competent Retrovirus During Product Manufacture and Patient Fol low-up. 2020.

3. EMA. Guideline on Development and Manufacture of Lentiviral Vectors. 2004.

4. EMA. Gene transfer medicinal products for human use. 2019.

5. 体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）. 2022.

《慢病毒载体RCL检测问题与解答（征求意见稿）》起草说明

一、起草目的

近年来，慢病毒载体在临床上得到广泛应用，其可以直接作为载体产品用于人体，也可以介导目的基因在靶细胞（如T细胞）的转移和表达以制备体外基因修饰细胞用于人体。目前大多数细胞和基因治疗产品需要使用病毒载体，这类病毒载体在临床应用时存在较大的安全性风险即可复制型慢病毒（Replication competent virus, RCL）的风险。由于RCL具有在体内不可控复制、插入体内基因组、引入免疫原性等风险，因而不仅影响产品安全性，给临床患者的使用带来风险，而且还具有潜在的生物安全风险，在环境中传播造成污染和再次感染。但我国目前尚未颁布针对RCL检测的相关技术指南，且审评关注到RCL检测方法在检测样品、检测量、检测方法和方法学验证等方面存在诸多共性问题。因而，为提高企业研发和申报的规范性、建立科学规范的审评体系、加快国内细胞和基因治疗产品的高质量发展，药审中心针对RCL检测相关问题进行了梳理和分析，并形成这些问题的初步建议，以供申请人/检测机构参考。

二、起草过程

（一）前期调研论证情况

本问题与解答起草初期，起草小组调研了EMA、FDA及国内相关的指导原则和文献，汇总了针对RCL检测方法的研究进展及国内外相关指南的技术要求情况。

（二）起草及修订情况

2023年4月完成初稿，2023年6月15日组织召开了专家咨询会，邀请了国内外具有RCL检测经验的专家，包括科研院所专家和代表性企业专家，对RCL检测存在的共性问题进行了讨论并形成了初步共识。

2023年9月4日起草小组组织药审中心生物制品药学部肿瘤消化适应症小组对RCL检测相关问题及审评共识进行了讨论，并根据适应症小组反馈意见进行了修订。

2023年9月11日至14日征求生物制品药学部全体人员意见，现已完成《慢病毒载体RCL检测问题与解答》征求意见稿。

三、起草思路

本问题与解答征求意见稿主体内容涵盖四个方面，包括检测样品、检测量、检测方法及方法学验证，上述四个方面是影响RCL检测结果判断的重要因素，因而有必要形成统一共识。本问题与解答在参考FDA、EMA相关指导原则的同时，综合考虑了RCL检测技术目前存在的难点与挑战，充分体现了在确保产品安全性的前提下充分考虑方法选择的科学性。

四、主要内容

本问题与解答包括四部分内容，均是涉及RCL检测方法的四个关键要素。第一部分内容明确了检测样品选择的考虑。第二部分内容包括针对病毒上清液和生产终末细胞取样量的计算和一般考虑。第三部分内容包括针对检测方法中共培养过程阶段、终点检测方法选择、阳性对照病毒选择、抑制对照组设置、共培养细胞选择等基本考虑。第四部分是针对检测方法方法学验证的一般考虑。

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